FastKing gDNA Përziej RT SuperMix

ARN A-1 është e degraduar

—— Pastroni ARN me cilësi të lartë pa ndotje. Materiali nga i cili është marrë ARN duhet të jetë sa më i freskët që të jetë e mundur për të parandaluar degradimin e ARN. Analizoni integritetin e ARN -së në xhel të çnatyruar para reagimit të RT. Pas nxjerrjes së ARN -së, ajo duhet të ruhet në 100% formamid. Nëse përdoret frenuesi RNase, temperatura e ngrohjes duhet të jetë <45 ° C, dhe pH duhet të jetë më pak se 8.0, përndryshe frenuesi do të lëshojë të gjithë RNazën e lidhur. Për më tepër, frenuesi RNase duhet të shtohet në tretësira që përmbajnë 8 0.8 mM DTT.

ARN A-2 përmban frenues të reaksioneve të transkriptimit të kundërt

—— Frenuesit e anasjelltë të transkriptimit përfshijnë SDS, EDTA, glicerinë, pirofosfat natriumi, spermidinë, formamid, kripë guanidine, etj. Përzieni ARN -në e kontrollit me mostrën dhe krahasoni rendimentin me reagimin e ARN -së së kontrollit për të kontrolluar nëse ka një frenues. Lani reshjet e ARN -së me 70% (v/v) etanol për të hequr frenuesit.

A-3 Pjekja e pamjaftueshme e abetareve të përdorura për sintetizimin e fijes së parë të cDNA

—— Përcaktoni që temperatura e pjekjes është e përshtatshme për abetaret e përdorura në eksperiment. Për heksamerët e rastësishëm, rekomandohet të mbani temperaturën në 25 ° C për 10 min para se të arrini temperaturën e reagimit. Për abetaret specifike të gjeneve (GSP), provoni GSP të tjera, ose kaloni në oligo (dT) ose hexamer të rastit.

A-4 Sasi e vogël e ARN-së fillestare

—— Rritni sasinë e ARN -së. Për mostrat e ARN më pak se 50 ng, 0.1 μg deri 0.5 μg acetil BSA mund të përdoren në sintezën e fillesës së parë të cDNA

A-5 Sekuenca e synuar nuk shprehet në indet e analizuara.

—— Provoni indet e tjera.

Reagimi PCR A-6 dështon

—— Për RT-PCR me dy hapa, modeli cDNA në hapin PCR nuk mund të kalojë 1/5 e vëllimit të reagimit.

A-1 Pjekja jo specifike e abetareve dhe shablloneve

—— Fundi 3’ i abetareve nuk duhet të përmbajë 2-3 dG ose dC. Përdorni abetaret specifike të Gjenit në sintezën e fillesë së parë në vend të abetareve të rastësishme ose oligo (dT). Përdorni një temperaturë më të lartë të pjekjes në ciklet e para, dhe më pas një temperaturë më të ulët të pjekjes. Përdorni polimerazën Taq të ADN-së për fillimin e nxehtë për PCR për të përmirësuar specifikën e reagimit.

A-2 Dizajn i dobët i abetareve specifike për gjenet

—— Ndiqni të njëjtat parime për hartimin e abetareve të amplifikimit.

ARN A-3 e kontaminuar me ADN gjenomike

—— Trajtoni ARN me DNase I. të shkallës PCR. Vendosni një reagim kontrolli pa transkriptim të kundërt për të zbuluar ndotjen e ADN-së.

A-4 Formimi i dimerit të abetares

——Dizenjoni abetare pa sekuenca plotësuese në fundin 3 ’.

A-5 Mg shumë të lartë²⁺ përqendrimit

—— Optimizoni Mg²⁺ përqendrim për secilin kombinim shablloni dhe abetare

A-6 I kontaminuar me ADN të huaj

—— Përdorni këshilla rezistente ndaj aerosoleve dhe enzimat UDG.

A-1 Përmbajtja e produktit të fillesë së parë është shumë e lartë

—— Reduktoni sasinë e produktit të fillesë së parë në hapin konvencional të reagimit të PCR.

A-2 Sasia abetare shumë e lartë në reaksionin PCR

——Reduktoni hyrjen e abetareve.

A-3 Shumë cikle

—— Optimizoni kushtet e reagimit të PCR dhe zvogëloni numrin e ciklit të PCR.

A-4 Temperaturë shumë e ulët e pjekjes

——Rritni temperaturën e pjekjes për të parandaluar fillimin dhe shtrirjen jo specifike.

A-5 Amplifikimi jo-specifik i fragmenteve të oligonukleotideve të krijuara nga degradimi i ADN-së në ADN-—Nxirrni ARN me cilësi të lartë për të parandaluar ndotjen e ADN-së.

RT-PCR është që të transkriptojë ARN në cDNA, dhe më pas të përdorë cDNA të transkriptuar anasjelltas si një model për reagimin PCR për të amplifikuar fragmentin e synuar. Zgjidhni ose abetaret e rastësishme, Oligo dT dhe abetaret specifike të gjeneve sipas kushteve specifike të eksperimentit. Të gjithë abetaret e mësipërme mund të përdoren për mRNA të qelizave eukariote të shkurtra pa strukturë fije floku.

Abetare e rastësishme: I përshtatshëm për ARN të gjatë me strukturë fije floku, si dhe për të gjitha llojet e ARN-ve si rRNA, mRNA, tRNA, etj. Ato përdoren kryesisht për reagimin RT-PCR të një shablloni të vetëm.

Oligo dT: I përshtatshëm për ARN me bisht PolyA (ARN prokariotike, eukariotike Oligo dT ARNi dhe ARN nuk kanë bishta PolyA). Për shkak se Oligo dT është i lidhur me bishtin PolyA, cilësia e mostrave të ARN-së kërkohet të jetë e lartë, dhe madje edhe një sasi e vogël e degradimit do të zvogëlojë shumë sasinë e sintezës së cDNA me gjatësi të plotë.

Abetare specifike për gjenet: Plotësuese e sekuencës së modelit, e përshtatshme për situatat ku rendi i synuar është i njohur.

Ka dy mënyra:

1. Metoda e referencës së brendshme: Në teori, cDNA është fragmente ADN me gjatësi të ndryshme, kështu që rezultati i elektroforezës është njollosja. Nëse bollëku i ARN -së është i ulët, asnjë produkt nuk do të shfaqet në elektroforezë, por kjo nuk do të thotë që asnjë produkt nuk do të amplifikohet me PCR. Në përgjithësi, referenca e brendshme mund të përdoret për të zbuluar cDNA. Nëse referenca e brendshme ka rezultate, cilësia e cDNA mund të garantohet në thelb (në disa raste, nëse fragmenti i gjenit të synuar është shumë i gjatë, mund të ketë përjashtime).

2. Nëse ekziston një gjen i njohur i përforcuar nga ky model, ai mund të verifikohet nga abetaret e këtij gjeni. Përforcimi i referencës së brendshme nuk do të thotë domosdoshmërisht se nuk ka problem me cDNA. Për shkak se referenca e brendshme ka bollëk të lartë në cDNA, është e lehtë të amplifikohet. Nëse cDNA është degraduar pjesërisht për arsye të ndryshme, nga perspektiva e probabilitetit, rezultatet e PCR të gjeneve të synuara me bollëk të ulët do të preken shumë. Ndërsa referenca e brendshme është ende në sasi të madhe, amplifikimi ndoshta nuk do të ndikohet.

Degradimi pjesërisht i ARN -së. Zbuloni integritetin dhe pastroni ARN -në

Përmbajtja e ARN -së së specieve të ndryshme mund të jetë e ndryshme, por në përgjithësi, ARN -ja totale e nxjerrë duhet të përmbajë dy breza të qartë 28S dhe 18S në elektroforezën e xhelit, dhe shkëlqimi i brezit të mëparshëm duhet të jetë dy herë më i lartë se ai i këtij të fundit. Brezi 5S tregon se ARN është degraduar dhe shkëlqimi i saj është proporcional me shkallën e degradimit. Përforcimi i suksesshëm i referencës së brendshme nuk do të thotë që nuk ka asnjë problem me ARN -në, sepse referenca e brendshme është në sasi të madhe, ARN -ja mund të amplifikohet për aq kohë sa degradimi nuk është i rëndë. OD₂₆₀/OD₂₈₀raporti i ARN -së së pastër të matur me spektrofotometër duhet të jetë midis 1.9 dhe 2.1. Një sasi e vogël e papastërtisë së proteinave në ARN do të zvogëlojë raportin. Përderisa vlera nuk është shumë e ulët, RT nuk do të preket. Ajo që ka më shumë rëndësi për RT është integriteti i ARN -së.

Zgjerimi i gjenit të referencës së brendshme mund të tregojë vetëm se RT ka pasur sukses, por nuk lidhet domosdoshmërisht me cilësinë e fillesës së cDNA. Për shkak se fragmentet e referencës së brendshme janë përgjithësisht të vogla në madhësi dhe të larta në shprehje, ato janë më të lehta për t'u bërë të suksesshme në transkriptimin e kundërt. Sidoqoftë, madhësia dhe shprehja e gjenit të synuar ndryshon nga gjeni në gjen. Cilësia e cDNA nuk mund të gjykohet vetëm me referencë të brendshme veçanërisht për fragmentet e synuara më të gjatë se 2 kb.

Disa mostra kanë struktura dytësore komplekse, ose kanë përmbajtje të pasur të GC, ose janë të çmuara me bollëk të ulët. Në këto raste, transkriptaza e kundërt duhet të zgjidhet sipas madhësisë së fragmentit të synuar dhe mostrës. Për modelet ARN me përmbajtje të lartë GC dhe strukturë komplekse dytësore, është e vështirë të hapet struktura dytësore në temperaturë të ulët, ose me transkriptazë të kundërt të zakonshme. Për këto shabllone, Quant Reverse Transcriptase mund të zgjidhet, meqë performanca e tij e kundërt e transkriptimit është padyshim më e mirë se ajo e transkriptazës së kundërt të serisë M-MLV, e cila mund të transkriptojë në mënyrë të efektshme modele të ndryshme të ARN-së dhe të transkriptojë ARN-në në vargun e parë të cDNA-së në masën maksimale. Kur përdorni çantën e përgjithshme të kundërt të transkriptazës, sistemi 20 μl mund të transkriptojë në mënyrë efektive vetëm 1 μg të ARN -së totale. Ju lutemi kushtojini vëmendje kapacitetit maksimal të kompletit RT. Nëse shablloni shtohet me tepri, transkriptimi i kundërt do të favorizojë ARN -në me bollëk të madh. Prandaj, është më mirë të mos tejkaloni kapacitetin maksimal të sistemit.

A-1 Përcaktoni nëse ARN është degraduar rëndë dhe nëse RT është e suksesshme

Në përgjithësi, arsyeja e dështimit të amplifikimit të referencës së brendshme shpesh shkaktohet nga degradimi serioz i ARN -së. Një arsye tjetër e mundshme është dështimi i kundërt i transkriptimit. Referenca e brendshme nuk mund të përdoret si standard për të gjykuar cilësinë e vargut të vetëm të cDNA, por mund të përdoret si standard për të gjykuar nëse transkriptimi i kundërt është i suksesshëm nëse nuk ka problem të cilësisë së ARN -së. Gjëja më e rëndësishme në procesin e transkriptimit të kundërt është të ruani një temperaturë konstante dhe një sistem reagimi konstant në mënyrë që të përmirësoni efikasitetin e reagimit.

A-2 Përcaktoni nëse abetaret për përforcimin e gjeneve të referencës së brendshme janë të besueshme dhe nëse ka ndonjë problem me reagentët e përdorur në PCR.

Për kuantifikim relativ, ARN duhet të kuantifikohet para transkriptimit të kundërt, i cili kërkohet gjithashtu në shumë komplete të transkriptimit të kundërt, për shembull, kuantifikoni hyrjen e ARN si 1 μg. Meqenëse cDNA e transkriptuar në të kundërt është një zgjidhje e përzier, duke përfshirë ARN, oligo dT, enzimë, dNTP dhe madje edhe pak mbetje të ADN -së, devijimi do të shkaktohet, kështu që është e pamundur të përcaktohet sasia e saktë e cDNA. Prandaj, kuantifikimi i ARN -së është i nevojshëm. Duke pasur parasysh që efikasiteti i transkriptimit të kundërt është i njëjtë midis mostrave të ndryshme, sasia e cDNA e marrë duhet të jetë e njëjtë, dhe analiza sasiore mund të tregojë krahasimin e niveleve të shprehjes së gjeneve të ndryshme në të njëjtën sasi të ARN -së totale. Kur kryeni PCR sasiore të fluoreshencës relative, cDNA sasiore mund të mos kërkohet pas transkriptimit të kundërt, sepse gjeni i referencës së brendshme mund të veprohet si referencë.

Ajo lidhet kryesisht me gjenet, dhe transkriptimi i kundërt i fragmentit të gjatë nuk është i realizueshëm për shumicën e gjeneve. Së pari, efikasiteti i transkriptimit të kundërt është shumë më i ulët se ai i PCR. Së dyti, rajoni i pasur me GC dhe struktura dytësore e shumë gjeneve kufizojnë transkriptimin e kundërt dhe PCR. Së fundi, besnikëria dhe efikasiteti i amplifikimit të PCR është e vështirë të garantohet në të njëjtën kohë. Në procesin e transkriptimit të kundërt, askush nuk mund të garantojë marrjen e fragmenteve të gjata për gjenet me kopje të ulët, veçanërisht duke përdorur oligo dT. Sa i përket 5 'UTR me më shumë GC, është edhe më e vështirë. Prandaj, është ende një metodë e arsyeshme për të ndryshuar transkriptimin me abetare të rastësishme, për të gjetur vendet e ndarjes natyrore në fragmentin e synuar, për të përforcuar me segmente, dhe më pas për të kryer tretjen dhe lidhjen e kufizimit. Në përgjithësi, është e vështirë të amplifikohen drejtpërdrejt fragmente më të mëdha se 2 kb, por nuk është gjithmonë e pamundur të merren: 1. Para së gjithash, garantoni integritetin e ARN/mRNA, dhe preferohet nxjerrja e TRIZOL. 2. Kompleti M-MLV RT-PCR mund të përdoret drejtpërdrejt. Zgjasni kohën e pjekjes dhe rrisni siç duhet numrin e ciklit në procesin e amplifikimit. Përndryshe, PCR e futur mund të aplikohet, ose të kryejë një ose dy reagime së pari me kohë të denaturimit dhe zgjatjes së duhur të zgjatur para amplifikimit normal të PCR, i cili mund të ndihmojë në shtrirjen e fragmenteve. Kushtojini vëmendje besnikërisë së polimerazës. 3. Long Taq mund të përdoret në PCR për të marrë rezultate ideale. 4. Për aplikimin e shprehjes së proteinave, duhet të aplikohet polimeraza me besnikëri të lartë.

Ekzistojnë dy lloje të transkriptazës së kundërt të ofruar nga TIANGEN: Quant/King RTase dhe TIANScript M-MLV. Dallimi kryesor midis tyre është sasia hyrëse e shablloneve. Quant është një transkriptazë e kundërt unike, e cila është e ndryshme nga M-MLV e përdorur zakonisht që rrjedh nga virusi i leukemisë moline Moloney. Quant është një transkriptazë e kundërt me efikasitet të lartë e shprehur në mënyrë rekombinante nga inxhinieri Escherichia coli. Quant është i përshtatshëm për amplifikimin e 50 ng-2 μg ARN me aktivitet të lartë transkriptimi të kundërt dhe rendiment të lartë. Krahasuar me MMLV ose AMV të zakonshme, karakteristika më e madhe e Quant është se ka një prirje shumë të fortë me modelet ARN dhe mund të përmbysë modele komplekse të transkriptimit pa çnatyrim të temperaturës së lartë. Për modelet me përmbajtje më të lartë të GC, efikasiteti i kundërt është më i lartë. Sidoqoftë, kjo transkriptazë e kundërt ka aktivitet RNase H, e cila mund të ndikojë në gjatësinë e produktit cDNA (i përshtatshëm për modele <4.5 kb). Për transkriptimin e kundërt konvencional, rekomandohet transkriptaza e kundërt TIANScript MMLV. Kjo RTase është një enzimë e modifikuar me aktivitet shumë të dobët të RNase H, e cila është e përshtatshme për sintezë të gjatë (> 5 kb) cDNA.

Transkriptimi i kundërt me një hap dhe amplifikimi PCR përfundojnë në të njëjtin tub pa hapur kapakun e tubit midis sintezës dhe amplifikimit të cDNA, gjë që është e dobishme për të zvogëluar ndotjen. Meqenëse të gjitha mostrat e marra të cDNA përdoren për amplifikim, ndjeshmëria është më e lartë, me një minimum prej 0.01 pg të ARN -së totale. Për RTPCR të suksesshëm me një hap, abetaret specifike të gjeneve zakonisht përdoren për të filluar sintezën e cDNA. Metoda me dy hapa, përkatësisht transkriptimi i kundërt dhe amplifikimi i PCR kryhet në dy hapa. Së pari, transkriptimi i kundërt kryhet nga një model ARN për të marrë cDNA, dhe cDNA e marrë i nënshtrohet një ose më shumë reaksioneve të ndryshme PCR. Metoda me dy hapa mund të përdorë oligo (dT) ose abetare të rastësishme për të udhëhequr sintezën e fillesës së parë të cDNA, dhe mund të transkriptojë në mënyrë të kundërt të gjithë informacionin e ARNi nga një mostër specifike.