Përzierje e Amplifikimit TIANSeq HiFi

Aktualisht, teknologjia e renditjes së renditjes së lartë është e bazuar kryesisht në teknologjinë e sekuencimit të gjeneratës tjetër. Meqenëse gjatësia e leximit të teknologjisë së sekuencimit të gjeneratës tjetër është e kufizuar, ne duhet të ndajmë sekuencën me gjatësi të plotë në biblioteka të fragmenteve të vogla për të renditur. Sipas nevojave të eksperimenteve të ndryshme të renditjes, ne zakonisht zgjedhim sekuencimin me një fund ose sekuencimin me dy përfundime. Aktualisht fragmentet e ADN-së të bibliotekës së sekuencimit të gjeneratës tjetër shpërndahen përgjithësisht në rangun prej 200-800 bp.

a) ADN -ja është e dobët në cilësi dhe përmban frenues. Përdorni mostra të ADN-së me cilësi të lartë për të shmangur frenimin e aktivitetit të enzimave.

b) Sasia e mostrës së ADN-së është e pamjaftueshme kur përdoret metoda pa PCR për të ndërtuar bibliotekën e ADN-së. Kur hyrja e ADN-së së fragmentuar tejkalon 50 ng, rrjedha e punës pa PCR mund të kryhet në mënyrë selektive gjatë procesit të ndërtimit të bibliotekës. Nëse numri i kopjeve të bibliotekës është shumë i ulët për t'u renditur drejtpërdrejt, biblioteka e ADN -së mund të amplifikohet me PCR pas lidhjes së përshtatësit.

c) Ndotja e ARN -së çon në kuantifikim fillestar të pasaktë të ADN -së Ndotja e ARN -së mund të ekzistojë në procesin e pastrimit të ADN -së gjenomike, e cila mund të çojë në kuantifikim të pasaktë të ADN -së dhe ngarkim të pamjaftueshëm të ADN -së gjatë ndërtimit të bibliotekës. ARN mund të hiqet duke u trajtuar me RNase.

A-1

a) Shfaqen fragmente të vogla (60 bp-120 bp) Fragmentet e vogla zakonisht janë fragmente përshtatës ose dimerë të formuar nga përshtatës. Pastrimi me rruaza magnetike Agencourt AMPure XP mund të heqë në mënyrë efektive këto fragmente të përshtatësit dhe të sigurojë cilësi të sekuencimit.

b) Fragmente të mëdha shfaqen në bibliotekë pas amplifikimit të PCR Madhësia e fragmentit të ADN -së së bibliotekës do të rritet me 120 bp pasi të lidhet përshtatësi. Nëse fragmenti i ADN -së rritet me më shumë se 120 bp pas lidhjes së përshtatësit, mund të shkaktohet nga amplifikimi jonormal i fragmentit të amplifikimit të tepërt të PCR. Reduktimi i numrit të cikleve të PCR mund të parandalojë situatën.

c) Madhësia jonormale e fragmenteve të ADN -së së bibliotekës pas lidhjes së përshtatësit Gjatësia e përshtatësit në këtë çantë është 60 bp. Kur dy skajet e fragmentit lidhen me përshtatësit, gjatësia do të rritet vetëm me 120 bp. Kur përdorni një përshtatës të ndryshëm nga ai i dhënë nga ky komplet, ju lutemi kontaktoni furnizuesin për të siguruar informacionin përkatës siç është gjatësia e përshtatësit. Ju lutemi sigurohuni që rrjedha e punës dhe funksionimi i eksperimentit ndiqni hapat e përshkruar në manual.

d) Madhësia jonormale e fragmentit të ADN -së para lidhjes së përshtatësit Arsyeja për këtë problem mund të shkaktohet nga kushtet e gabuara të reagimit gjatë fragmentimit të ADN -së. Koha të ndryshme reagimi duhet të përdoren për hyrje të ndryshme të ADN -së. Nëse hyrja e ADN-së është më shumë se 10 ng, ne rekomandojmë që të zgjidhni kohën e reagimit prej 12 min si kohë fillestare për optimizim, dhe madhësia e fragmentit të prodhuar në këtë kohë është kryesisht në intervalin 300-500 bp. Përdoruesit mund të rrisin ose ulin gjatësinë e fragmenteve të ADN-së për 2-4 min sipas kërkesave të tyre për të optimizuar fragmentet e ADN-së me madhësinë e kërkuar.

A-2

a) Koha e copëzimit nuk është e optimizuar Nëse ADN -ja e fragmentuar është shumë e vogël ose shumë e madhe, ju lutemi referojuni Udhëzimeve për Zgjedhjen e Kohës së Fragmentimit të dhëna në udhëzim për të përcaktuar kohën e reagimit, dhe përdorni këtë pikë kohore si kontroll, gjithashtu vendosni një sistemi i reagimit për të zgjatur ose shkurtuar 3 minuta për të bërë rregullim më të saktë në kohën e fragmentimit.

A-3

Shpërndarja jonormale e madhësisë së ADN -së pas trajtimit të fragmentimit

a) Metoda e gabuar e shkrirjes së reagentit të fragmentimit, ose reagenti nuk përzihet plotësisht pas shkrirjes. Shkrini reagentin 5 × Fragmentation Enzyme Mix në akull. Pasi të jetë shkrirë, përzieni reagentin në mënyrë të barabartë duke lëvizur butësisht në fund të tubit. Mos e rrotulloni reagentin!

b) Mostra e hyrjes së ADN -së përmban EDTA ose ndotës të tjerë Rënia e joneve të kripës dhe agjentëve kelitues në hapin e pastrimit të ADN -së është veçanërisht e rëndësishme për suksesin e eksperimentit. Nëse ADN -ja tretet në 1 × TE, përdorni metodën e dhënë në udhëzim për të kryer fragmentimin. Nëse përqendrimi i EDTA në tretësirë ​​është i pasigurt, rekomandohet pastrimi i ADN -së dhe shpërndarja e saj në ujë të deionizuar për reagimin pasues.

c) Kuantifikimi fillestar i pasaktë i ADN -së Madhësia e ADN -së së fragmentuar është e lidhur ngushtë me sasinë e hyrjes së ADN -së. Para trajtimit të copëzimit, kuantifikimi i saktë i ADN -së duke përdorur Qubit, Picogreen dhe metoda të tjera është thelbësor për të përcaktuar sasinë e saktë të ADN -së në sistemin e reagimit.

 d) Përgatitja e sistemit të reagimit nuk ndjek udhëzimet Përgatitja e sistemit të fragmentuar të reagimit duhet të kryhet në akull në mënyrë rigoroze sipas udhëzimeve. Për të siguruar efektin më të mirë, të gjithë përbërësit e reagimit duhet të vendosen në akull dhe përgatitja e sistemit të reagimit duhet të kryhet pas ftohjes së plotë. Pasi të ketë përfunduar përgatitja, ju lutemi lëvizni lehtë ose pipetoni për t'u përzier plotësisht. Mos vorbulloni!

1. Metoda e gabuar e përzierjes (vorbull, lëkundje e dhunshme, etj.) Do të shkaktojë shpërndarje jonormale të fragmenteve të bibliotekës (siç tregohet në figurën e mëposhtme), duke ndikuar kështu në cilësinë e bibliotekës. Prandaj, kur përgatitni tretësirën e reaksionit të Fragmentation Mix, ju lutemi me pipetë lart dhe poshtë për përzierje, ose përdorni majën e gishtit për të lëvizur dhe përzier në mënyrë të barabartë. Kini kujdes që të mos përzieni me vorbullën.

2. ADN me pastërti të lartë duhet të përdoret për ndërtimin e bibliotekës

Integrity Integriteti i mirë i ADN -së: Brezi i elektroforezës është më shumë se 30 kb, pa bisht

OD260/230:> 1.5

OD260/280: 1.7-1.9

3. Sasia e hyrjes së ADN -së duhet të jetë e saktë Sugjerohet të përdoren metoda Qubit dhe PicoGreen për të përcaktuar sasinë e ADN -së, në vend të Nanodrop.

4. Përmbajtja e EDTA në tretësirën e ADN -së duhet të përcaktohet EDTA ka një ndikim të madh në reagimin e fragmentimit. Nëse përmbajtja e EDTA është e lartë, pastrimi i ADN -së duhet të kryhet para testit pasues.

5. Zgjidhja e reaksionit të fragmentimit duhet të përgatitet në akull Procesi i fragmentimit është i ndjeshëm ndaj temperaturës dhe kohës së reagimit (veçanërisht pas shtimit të përforcuesit). Për të siguruar saktësinë e kohës së reagimit, ju lutemi përgatitni sistemin e reagimit në akull.

6. Koha e reagimit të fragmentimit duhet të jetë e saktë Koha e reagimit të hapit të fragmentimit do të ndikojë drejtpërdrejt në madhësinë e produkteve të fragmentit, duke ndikuar kështu në shpërndarjen e madhësisë së fragmenteve të ADN -së në bibliotekë.

1. Çfarë lloj mostre është e zbatueshme për këtë komplet?

Mostra e aplikueshme e këtij kompleti mund të jetë ARN totale ose ARNi e pastruar me integritet të mirë të ARN -së. Nëse ARN -ja totale përdoret për të ndërtuar bibliotekën, rekomandohet të përdorni kompletin e shterimit të ARN -së (Cat#4992363/4992364/4992391) për të hequr së pari ARN -në.

2. A mund të përdoren mostrat FFPE për ndërtimin e bibliotekës me këtë çantë?

ARNi në mostrat e FFPE do të degradohet në një masë të caktuar, me integritet relativisht të dobët. Kur përdorni këtë çantë për ndërtimin e bibliotekës, rekomandohet të optimizoni kohën e fragmentimit (shkurtoni kohën e fragmentimit ose mos kryerjen e fragmentimit).

3. Duke përdorur hapin e përzgjedhjes së madhësisë të dhënë në manualin e produktit, çfarë mund të shkaktojë që segmenti i futur të shfaqet me një devijim të vogël?

Përzgjedhja e madhësisë do të bëhet në përputhje të rreptë me hapin e përzgjedhjes së madhësisë në këtë manual produkti. Nëse ka devijim, arsyeja mund të jetë që rruazat magnetike nuk janë të balancuara në temperaturën e dhomës ose nuk janë të përziera plotësisht, pipeta nuk është e saktë ose lëngu mbetet në majë. Rekomandohet të përdorni këshilla me adsorbim të ulët për eksperimentin.

4. Përzgjedhja e përshtatësve në ndërtimin e bibliotekës

Kompleti i ndërtimit të bibliotekës nuk përmban reagens përshtatës, dhe rekomandohet që të përdorni këtë çantë së bashku me Përshtatësin me Indeks të Vetëm TIANSeq (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC e bibliotekës

Zbulimi sasior i bibliotekës: Qubit dhe qPCR përdoren për të përcaktuar përkatësisht përqendrimin në masë dhe përqendrimin molar të bibliotekës. Funksionimi është rreptësisht në përputhje me manualin e produktit. Përqendrimi i bibliotekës në përgjithësi do të plotësojë kërkesat e sekuencimit të NGS. Zbulimi i gamës së shpërndarjes së bibliotekës: Përdorimi i Agilent 2100 Bioanalyzer për të zbuluar gamën e shpërndarjes së bibliotekës.

6. Përzgjedhja e numrit të ciklit të amplifikimit

Sipas udhëzimeve, numri i cikleve të PCR është 6-12, dhe numri i cikleve të PCR të nevojshme duhet të zgjidhet sipas hyrjes së mostrës. Në bibliotekat me rendiment të lartë, amplifikimi zakonisht ndodh në shkallë të ndryshme, i cili manifestohet nga një kulm pak më i madh pas kulmit të intervalit të synuar në zbulimin e Bioanalyzer Agilent 2100, ose përqendrimi i zbuluar i Qubit është më i ulët se ai i qPCR. Përforcimi i butë mbi të është një fenomen normal, i cili nuk ndikon në sekuencën e bibliotekës dhe analizën pasuese të të dhënave.

7. Spikes shfaqet në profilin e zbulimit të Agilent 2100 Bioanalyzer

Shfaqja e pikave në zbulimin e Agilent Bioanalyzer është për shkak të fragmentimit të pabarabartë të mostrave, ku do të ketë më shumë fragmente në madhësi të caktuar, dhe kjo do të bëhet më e dukshme pas pasurimit të PCR. Në këtë rast, sugjerohet që të mos kryhet përzgjedhja e madhësisë, dmth. Të vendoset gjendja e fragmentimit në 94 ° C për 15 minuta të inkubuar, ku shpërndarja e fragmentit është e vogël dhe e koncentruar, dhe homogjeniteti mund të përmirësohet.