2 × Pfu PCR Mix

Modeli A-1

■ Shablloni përmban papastërti të proteinave ose frenues të Taq, etj. —— Pastroni modelin e ADN -së, hiqni papastërtitë e proteinave ose nxirrni ADN -në e shabllonit me komplete pastrimi.

■ Çnatyrimi i shabllonit nuk është i plotë —— Rritni në mënyrë të përshtatshme temperaturën e denatyrimit dhe zgjasni kohën e denatyrimit.

Deg Degradimi i modelit ——Përgatitni sërish shabllonin.

Abetare A-2

Quality Cilësi e dobët e abetareve —— Ri-sintetizoni abetaren.

Deg Degradimi i abetareve - —Aksitoni abetaret me përqendrim të lartë në vëllim të vogël për ruajtje. Shmangni ngrirjen dhe shkrirjen e shumëfishtë ose krio-ruajtur afatgjatë 4 ° C.

Design Dizajnimi jo i duhur i abetareve (p.sh. gjatësia e abetareve nuk është e mjaftueshme, dimeri i formuar midis abetareve, etj.)

A-3 Mg²⁺përqendrimit

■ Mg²⁺ Përqendrimi është shumë i ulët —— Rritni siç duhet Mg²⁺ përqendrimi: Optimizoni Mg²⁺ përqendrimi nga një seri reagimesh nga 1 mM në 3 mM me një interval prej 0.5 mM për të përcaktuar Mg optimale²⁺ përqendrim për çdo shabllon dhe abetare.

A-4 Temperatura e pjekjes

Temperature Temperatura e lartë e pjekjes ndikon në lidhjen e abetares dhe shabllonit. —— Ulni temperaturën e pjekjes dhe optimizoni gjendjen me një gradient prej 2 ° C.

A-5 Koha e zgjatjes

Time Koha e shkurtër e zgjatjes —— Rritja e kohës së zgjatjes.

Fenomene: Mostrat negative gjithashtu tregojnë brezat e sekuencave të synuara.

A-1 Kontaminimi i PCR

Ndotja e kryqëzuar e sekuencës së synuar ose produkteve të amplifikimit —— Me kujdes që të mos pipetoni mostrën që përmban sekuencën e synuar në mostrën negative ose mos i derdhni nga tubi i centrifugës. Reagentët ose pajisjet duhet të autoklavohen për të eliminuar acidet nukleike ekzistuese, dhe ekzistenca e ndotjes duhet të përcaktohet përmes eksperimenteve të kontrollit negativ.

Ndotja e reagentit —— Lini reagentët dhe ruajini në temperaturë të ulët.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ Përqendrimi është shumë i ulët —— Rritni siç duhet Mg²⁺ përqendrimi: Optimizoni Mg²⁺ përqendrimi nga një seri reagimesh nga 1 mM në 3 mM me një interval prej 0.5 mM për të përcaktuar Mg optimale²⁺ përqendrim për çdo shabllon dhe abetare.

Design Hartimi i parregullt i abetareve, dhe sekuenca e synuar ka homologji me sekuencën jo të synuar. —— Abetaret e ri-dizajnuara.

Fenomene: Shiritat e amplifikimit PCR nuk janë në përputhje me madhësinë e pritshme, të mëdha ose të vogla, ose ndonjëherë ndodhin të dyja brezat e amplifikimit specifik dhe brezat e amplifikimit jo-specifik.

Abetare A-1

Specific Specifikë e dobët e abetareve

—— Abetare e ridizajnuar.

Concentration Përqendrimi i abetareve është shumë i lartë —— Rritni siç duhet temperaturën e denatyrimit dhe zgjasni kohën e denatyrimit.

A-2 Mg²⁺ përqendrimit

■ Mg²⁺ përqendrimi është shumë i lartë —— Ulni siç duhet përqendrimin e Mg2+: Optimizoni Mg²⁺ përqendrimi nga një seri reagimesh nga 1 mM në 3 mM me një interval prej 0.5 mM për të përcaktuar Mg optimale²⁺ përqendrim për çdo shabllon dhe abetare.

A-3 Polimerazë termostabile

Amount Sasia e tepërt e enzimës —— Reduktoni sasinë e enzimës në mënyrë të përshtatshme në intervale prej 0.5 U.

A-4 Temperatura e pjekjes

Temperature Temperatura e pjekjes është shumë e ulët —— Rritni në mënyrë të përshtatshme temperaturën e pjekjes ose miratoni metodën e pjekjes me dy faza

Ciklet A-5 PCR

■ Shumë cikle PCR —— Zvogëloni numrin e cikleve të PCR.

Abetare A-1—— Specifikiteti i dobët —— Rizajnoni abetaren, ndryshoni pozicionin dhe gjatësinë e abetares për të rritur specifikën e saj; ose të kryejë PCR të futur.

ADN-ja e modelit A-2

—— Shablloni nuk është i pastër ——Pastroni shabllonin ose nxirrni ADN -në me komplete pastrimi.

A-3 Mg²⁺ përqendrimit

- —Mg²⁺ përqendrimi është shumë i lartë —— Ulni siç duhet Mg²⁺ përqendrimi: Optimizoni Mg²⁺ përqendrimi nga një seri reagimesh nga 1 mM në 3 mM me një interval prej 0.5 mM për të përcaktuar Mg optimale²⁺ përqendrim për çdo shabllon dhe abetare.

A-4 dNTP

—— Përqendrimi i dNTP -ve është shumë i lartë ——Ulni përqendrimin e dNTP -së në mënyrë të përshtatshme

A-5 Temperatura e pjekjes

—— Temperaturë shumë e ulët e pjekjes —— Rritni në mënyrë të përshtatshme temperaturën e pjekjes

Ciklet A-6

—— Shumë cikle —— Optimizoni numrin e ciklit

Hapi i parë është të zgjidhni polimerazën e duhur. Polimeraza e rregullt Taq nuk mund të korrigjohet për shkak të mungesës së aktivitetit të ekzonukleazës 3'-5 'dhe mospërputhja do të zvogëlojë shumë efikasitetin e zgjerimit të fragmenteve. Prandaj, polimeraza e rregullt Taq nuk mund të amplifikojë në mënyrë efektive fragmentet e synuara më të mëdha se 5 kb. Polimeraza Taq me modifikim të veçantë ose polimerazë tjetër me besnikëri të lartë duhet të zgjidhet për të përmirësuar efikasitetin e zgjerimit dhe për të përmbushur nevojat e amplifikimit të fragmenteve të gjata. Për më tepër, amplifikimi i fragmenteve të gjata kërkon gjithashtu rregullimin përkatës të modelit të abetareve, kohën e çnaturimit, kohën e zgjatjes, pH tampon, etj. Zakonisht, abetaret me 18-24 bp mund të çojnë në rendiment më të mirë. Për të parandaluar dëmtimin e shabllonit, koha e denatyrimit në 94 ° C duhet të reduktohet në 30 sek ose më pak për cikël, dhe koha për të rritur temperaturën në 94 ° C para amplifikimit duhet të jetë më pak se 1 min. Për më tepër, vendosja e temperaturës së shtrirjes në rreth 68 ° C dhe dizajnimi i kohës së zgjatjes sipas shkallës prej 1 kb/min mund të sigurojë amplifikim efektiv të fragmenteve të gjata.

Shkalla e gabimit të amplifikimit PCR mund të zvogëlohet duke përdorur polimeraza të ndryshme të ADN -së me besnikëri të lartë. Ndër të gjitha polimerazat e ADN -së Taq të gjetura deri më tani, enzima Pfu ka shkallën më të ulët të gabimit dhe besnikërinë më të lartë (shiko tabelën e bashkangjitur). Përveç përzgjedhjes së enzimave, studiuesit mund të zvogëlojnë më tej shkallën e mutacionit të PCR duke optimizuar kushtet e reagimit, duke përfshirë optimizimin e përbërjes tampon, përqendrimin e polimerazës termostabile dhe optimizimin e numrit të ciklit të PCR.